搜論文知識網
您當前的位置:首頁 > 論文 > 醫學論文 > 藥學論文>納米藥物載體的結構修飾實現內體逃逸>正文

納米藥物載體的結構修飾實現內體逃逸

來源:搜論文知識網位置:藥學論文時間:2019-05-22 09:41

   摘 要: 納米藥物載體因其良好的生物相容性、組織滲透性、無毒、易吸收等特性,得到廣泛應用。藥物載體進入靶向部位發揮作用需要以內吞方式進入細胞,在此過程中,內體的屏障作用是限制其發揮藥效的重要因素。從逃逸機制出發,總結了逃逸劑通過質子化效應、膜融合或膜孔形成、膜破壞及屏蔽免疫等方式實現內體逃逸。綜述了以聚合物材料、多肽、光化學試劑、pH 敏感材料等為逃逸劑,對載體材料進行修飾,實現內體逃逸的方法,最后對載體內體逃逸的發展進行了展望。

  關鍵詞: 藥物載體; 內體逃逸; 質子化; 光化學內化; 結構修飾

納米藥物載體的結構修飾實現內體逃逸

  1 前 言

  納米載體作為一種亞微粒輸送系統,能大大提高藥物的吸收度和穩定性,改善藥物性質和靶向性,加快基因轉染速率,延長作用時間,增加療效,已廣泛應用于腫瘤、血管疾病的治療[1,2]。目前廣泛應用的納米載體主要包括膠束、脂質體、樹枝狀大分子、聚合物納米顆粒等[1,3,4],其包載藥物進入機體,通過調節載體的表面電荷、粒徑大小或與相應配體結合等方式突破細胞膜[5,6]; 在跨膜過程中形成內涵體,隨著內涵體被溶酶體內吞,進入到溶酶體[3,4,7]。一般載體會因為在內體中的長時間停留,由于內涵體/溶酶體內酸性環境( pH 約 4. 0~6. 0) 及大量酶的存在導致載體水解,造成包載物質的滲漏,改變其結構、穩定性,嚴重影響所包載藥物的治療效果[8,9],如圖 1 所示。因此,針對內體逃逸的機制,研究人員對藥物載體材料進行結構修飾,從而達到內體 逃 逸 的 目 的,提 高 藥 物 療 效, 降 低 藥 物 毒 副作用[10]。

  2 藥物載體內體逃逸的方式

  藥物載體經過內吞進入細胞,由于內吞胞質的 pH 值從早期內涵體( pH 5. 5 ~ 6. 5) 到晚期內涵體( pH 4. 5 ~ 5. 5) ,最后 到 溶 酶 體( pH < 5) ,呈現出逐漸降低的過程[11],因此,藥物載體可通過與內體逃逸劑結合實現內體逃逸。常用內體逃逸劑如表 1 所示。

  2. 1 利用質子化效應脹破內體膜

  質子化效應是通過具有高緩沖能力的質子化劑介導,在質子化時,能夠自由膨脹,使得內體內滲透壓升高,引起大量的水和離子內流進入內體,導致內體膜脹破,從而將內體內包裹的物質釋放,實現內體逃逸[12],如圖 2 所示。有研究表明,叔胺基團能在酸性條件下吸附質子,使物質免受酸性環境的影響,同時其質子化介導能力會增大內體滲透壓,脹破內體膜,將物質從內體中釋放出來[13]。另有研究表明,富含組氨酸的分子由于咪唑基的存在,具有很好的質子介導作用,也會導致內體膜的破裂[14]。

  2. 2 通過膜的融合實現跨膜

  另一種內體逃逸機制是實現膜的融合,降低內體膜的穩定性[12]。對細胞而言,細胞膜由磷脂雙分子層構成,膜內是疏水環境,而膜兩側為水環境。而 α-螺旋類似于 DNA 雙螺旋,具有 NCCNCCNCC 骨架結構,能夠將疏水基團放在骨架外側,將親水基團置于內側,膜蛋白能夠以 α-螺旋實現單次或多次跨膜[15]。

  2. 3 通過形成膜孔穿過內體膜

  通常,孔的形成是基于膜張力和線張力之間的相互作用( 圖 3) 。膜張力大形成孔,線張力大關閉孔。多肽的一些組件和孔的邊緣具有較高的親和力,故將多肽結合到聚合物表面可以減少線張力,從而增加孔的形成數量,保 持 孔 徑 的 穩 定[16]。 如將陽離子兩親性多肽 ( AMPs) 與脂質雙分子層結合即會導致其內部應力和內膜張力的增加,足夠使膜形成孔隙[17]。Kim 等[18]報道了一種細胞質穿透抗體 TMab4,其在酸性環境下會發生構象的變化,導致內體膜孔的形成,從而實現內體逃逸。為研究其內體逃逸行為,用 TMab4 脈沖 Hela 細胞,隨后用不同內體標記物進行染色,結果表明在內吞 2 h 后, TMab4 出現在內體中,在 6 h 后,逃逸到細胞質中,實現逃逸。

  2. 4 光化學內化破壞內體膜

  利用光化學作用激活進入細胞的光敏分子,產生活性氧( reactive oxygen species,ROS) ,破壞內體膜的過程稱之為 光 化 學 內 化 ( photochemical internalization,PCI) 。光敏分子通過附著、包載等方式進入細胞,在光的照射下,釋放 ROS,使內體膜氧化破裂,釋放 內 容 物[19,20] ( 圖 4) 。Selbo 等[21] 將 光 敏 劑 TPCS2a ( 紅 色 熒 光) 與 Alexa-488( 綠色熒光) 標記的 AC133 皂草素和 WiDr 細胞共孵育 18 h 后,觀察到熒光共定位于內體中。曝光 1 h 后,在整個胞質中均發現有彌散的熒光顯影,說明 PCI 誘導的皂草素成功實現逃逸。

  2. 5 免疫響應的屏蔽

  仿生粒子的引入,可以達到屏蔽免疫系統響應的效果,實現免疫逃逸,同時使納米粒子具有生物特性,對特定組織、細胞具有靶向作用。Zhang 等[22] 從血液中分離出血小板,由于血小板外側膜為負電性,聚乳酸-羥基乙酸( poly( lactic-co-glycolic acid) ,PLGA) 納米粒子也為負電性,利用靜電排斥理論使體系構成“right-side-out”結構,血小板上的各種蛋白得以保留并朝向外側,使得最終的體系既有納米粒子載體特性,又有血小板活性。結果表明,血小板膜覆蓋的納米粒子,能有效結合人膠原蛋白,并對孤立血管的損傷區域具有靶向作用。

  3 藥物載體為實現內體逃逸的結構修飾

  3. 1 聚合物修飾

  3. 1. 1 胺類聚合物

  胺類聚合物如聚乙烯亞胺( polyethyleneimine,PEI) 、聚酰胺-胺、氯化銨及甲胺等,其結構中含有大量的胺基,能夠吸附質子,避免藥物受酸性環境影響,還能增大內體內滲透壓,使離子內流,造成膜的脹破,實現內體逃逸[23,24]。Behr 等[25] 首先提出將 PEI 作為“質子海綿”,其緩沖能力在 pH7. 2 ~ 5. 0,他的研究小組假設這種聚合 物 可 以 通 過 滲 透 壓 失 衡 來破壞內體。Borchard 等[26]將 PEI 加入到 PLGA 溶液,得到 PLGA-PEI 納米顆粒,對該納米顆粒負載 DNA 后其在細胞內分布及表達進行定位。用羅丹明標記 DNA,6 h 后 DNA 進入內體,隨后一段時間在 Calu-3 細胞內檢測到蛋白表達,表明納米顆粒逃離內體。 Jiang 等[27]用富含胺的熒光碳納米粒子( FCNs) ,攜帶能夠減少 polo 樣激素( polo-like Kinase 1,Plk1) 表達的小干擾 RNA( siPlk1) ,制備得到帶有 Plk1 調節基因的碳納米粒子-基因復合物( C-siPlk1) ,用于癌癥治療。研究者用熒光染料 Cy5( 紅色熒光) 對 C-siPlk1 進行標記,得到 C-Cy5 siPlk1; 在 37 ℃下將人類黑色素瘤 A375 細胞與 Lysotracker( 綠色熒光) 共孵育 2 h,熒光標記內體; 隨后將含 Lysotracker 探針的 A375 細胞與 C-Cy5 siPlk1 在 37 ℃ 下共孵育 1 h。通過激光掃描共聚焦顯微鏡( confocal laser scanning microscope,CLSM) 觀察發現,A375 細胞與 CCy5 siPlk1 共孵育后,細胞能夠對 C-Cy5 siPlk1 持續攝取; 在 3~6 h 內,發現 Cy5 的紅色熒光與 Lysotracker 的綠色熒光共定位,表明 C-Cy5 siPlk1 被內體攝取; 進一步孵育 9 h 后,紅色熒光與綠色熒光逐漸分離,表明 CCy5 siPlk1 開始內體中成功逃逸,12 h 后,僅有少數 CCy5 siPlk1 未從內體逃逸( 圖 5) 。

  PEI 作為目前藥物遞送研究最成功的聚陽離子之一,能夠大大提高轉染效率,但其質子化作用越強,其細胞毒性也隨著增大[28,29]。因此,研究者們通過在聚合物上引入聚乙二醇( PEG) 、聚氧胺等非離子親水基團或直接添加陰離子來屏蔽陽離子電荷,或通過交聯可降解基團等,減少其對細胞膜結構的破 壞作用,降 低 細 胞 毒性[30]。Guan 等[31] 設計合成醛基修飾的 PEG,對 PEI/ DNA 復合物的正電荷進行屏蔽化; 復合物進入微酸性腫瘤區,在席夫堿鍵的 pH 響應下,PEG 脫落,發揮 PEI 的高效轉染作用。研究表明,在 pH 7. 4 條件下,PEI/ DNA 復合物的細胞存活率為 83. 2%,經過 PEG 屏蔽化后,細胞毒性明顯減輕。PEG 屏蔽化作用在提高穩定性和實現長循環的同時,降低了 PEI 的細胞毒性。Wang 等[32]設計具有負電荷和疏水基團的樹突狀 PEG 端粒大分子包封蛋白質-PEI 復合物,最大限度減少聚陽離子誘導的細胞毒性,同時端粒分子屏蔽層在細胞內蛋白質傳遞過程中能夠與納米復合物分離,恢復高轉染特性。另有研究者將陰離子聚合物硫酸葡聚糖( DS) 引入 PEI/DNA 復合物,得到粒徑 200 nm、分散系數 0. 2 的復合物微粒,隨著 DS 用量的增大,毒性降低[33]。

  3. 1. 2 咪唑類聚合物

  咪唑是分子結構中含有兩個間位氮原子的五元芳雜環化合物。咪唑基在 pH 小于 6 時,會被質子化[34]。由于內體的內環境 pH 較低,咪唑基團具有很好的質子化介導作用,促使“質子海綿效應”的發生。與胺類聚合物相比,聚組氨酸或聚咪唑類載體的轉染效率要更高,這可能與咪唑基能破壞內體膜的融合活性有關[35]。 Zhang 等[36]合成了 mPEG-PLA-Phis 共聚物膠束,使用吖啶橙定位測定和鈣黃綠素攝取研究共聚物對內體膜的破壞作用。細胞核和內體分別用 Hoechst33258( 藍色) 和 Lyso Tracker DND-26( 綠色) 標記。負載阿霉素( DOX) 的基于 Phis 的共聚物膠束被 MCF-7 細胞快速吸收,并在 15 min 后封裝于內體內。隨孵化時間增加,在細胞中橙色熒光( Lyso Tracker 和 DOX 的重疊) 增強,表明膠束在內體中聯系積累。4 h 后,發現強烈的紫色熒光( DOX 與 Hoechst 重疊) ,表明 DOX 從內體逃逸到細胞核中。聚( 4-乙烯基咪唑) ( poly( 4-vinylimidazole) ,P4V) 分子結構中含有大量咪唑環,在酸性條件下可接受質子,具有“質子海綿效應”。Jong 等[37] 研究了 P4V 作為非病毒基因遞送載體,研究表明,P4V 結合 DNA 在進入內體的酸性環境后會發生電荷的反轉,發生質子化作用,與 PEI 作用機理類似,可實現內體逃逸。

  3. 2 多肽的融合

  部分兩性分子多肽中含有酸性氨基酸,如谷氨酸,其帶有負電荷的羧基在中性條件下破壞多肽的 α-螺旋結構的穩定性,而在酸性環境中,促進親水親油的兩性螺旋結構的形成,通過與內體內膜的融合破壞內體。攜帶此種多肽序列的載體具有很強的內體逃逸能力[38]。蜂毒肽、聚精氨酸等堿性多肽能夠在酸性環境中形成 α-螺旋,此類構象的轉變能夠提高多肽與膜結構的親和性。目前 用 于 加 強 載 體 內 體 逃 逸 能 力 的 多 肽 有 蜂 毒 肽、 KALA、GALA[39-41]等。 Yeom 等[42] 將 KALA 多肽與 PEG 綴合以防止 PEIDNA 復合物自聚集,通過該配方得到穩定的 PEI/KALAPEG 復合物。以 PEI 為參照,通過熒光素標記的寡核苷酸和 C3 細胞中的 Cy3 標記的質粒 DNA,研究了 PEI/ KALA 的內體逃逸能力,結果表明,轉染 24 h 后,使用 PEI/KALA 的一組,細胞內的熒光復合物明顯高于 PEI,且熒光染色是在核內而非核外。這表明,KALA 的加入明顯增強 PEI 的質子化介導作用,增強載體內體逃逸能力。 Yu 及其研究小組[43] 得到二硫鍵修飾的富含樹枝狀精氨酸的陽離子肽。基因復合物可用熒光染料 Cy5 標記,熒光照射下顯紅色,而酸性內體可被 LysoSensor Yellow/ Blue DND-160 染成綠色。研究表明( 圖 6) ,與 PEI 相比,脂質-基因復合物組( RLS 及 RL) 在轉染 2 h,熒光即顯色為黃色熒光( 紅色與綠色疊加) ,表明進入內體環境; 在轉染 4 h 時,PEI 組出現黃色熒光斑點,表明 PEI 組也被內體吞噬,而此時的脂質-基因復合物組的有些熒光已經開始變為橙色或紅色,這表明紅色熒光量增加,證明更多的基因復合物逃離了內體環境,同時也表明,精氨酸多肽的逃逸效率較 PEI 明顯增加。 Kalina 等[44]設計了 pH 觸發的成孔肽,他們從 pH 不敏感的成孔肽 MelP5 序列的 18 432 個組合文庫中進行高通量篩選,確定了兩性螺旋極性表面的 5 個氨基酸殘基,其在 pH= 7 處為帶電、可溶狀態,在 pH= 5 下與膜結合,螺旋成孔,實現了內體逃逸。

  3. 3 添加光化學誘導劑

  采用光化學方法,使生物載體從內體通路釋放到包漿的 手 段,現已被廣泛研究[45]。許 多 光 敏 劑,包 括 TPPS4、TPPS2a、AIPcS2a和基于樹枝狀大分子的光敏劑 ( DP) 主要定位在內體的膜表面,暴露于光下后,這些光敏劑會引起 ROS 的形成,短時間內破壞內體膜,而細胞內容物仍能保持完整并被遞送至細胞質中[7,46]。 Yuan 等[47]報道了具有聚集誘導發射( AIE) 特征的光敏劑( PS) 與胺基丙烯酸酯( AA) 結合在光存在下,會產生 ROS。通過共焦激光掃描電鏡評估復合物的細胞內轉運特征,用吖啶橙為指標對 ROS 誘導的內體損壞進行評價,研究表明,Hela 細胞在沒有 ROS 參與下,呈紅色熒光( 內體) 和綠色熒光( 細胞器細胞核) ,而將其置于光照射下,紅色熒光顯著降低,表明內體被破壞,在細胞質中檢測到 YOYO-1 標記的 DNA,實現了內體逃逸( 圖 7) 。

  Kun 等[48]也報道了負載 DOX 和光誘導劑的聚合物膠束( D-LRPM) ,用熒光分別標記內體和細胞核,有光照射下內體熒光強度較無光照射明顯降低,且 DOX 在細胞核處的熒光強度增加,結果表明,D-LRPM 中光誘導劑產生的 ROS 能夠成功破壞內體膜,將包載物釋放至細胞質中。在研究過程中,PCI 技術僅通過光強度來進行調節,無光區域不會受到損失,進一步降低風險,是一種有效可控的逃逸方式[20]。

  3. 4 pH 敏感材料的結合

  pH 敏感型材料是一類能夠響應所在環境 pH 值的微小變化,其分子結構和物理性能發生一定變化的新型材料。在機體病變細胞,以腫瘤細胞為例,腫瘤微環境具有低 O2、pH 降低、間質高壓、血管高滲透性等特點,生理狀態下,正常組織細胞外 pH 介于 7. 2~7. 4,而惡性腫瘤細胞外 pH 介于 6. 5 ~ 6. 9 之間[49]。通過在藥物載體上引入 pH 敏感型材料,使其僅在靶點特定 pH 條件下完成藥物釋放,既實現了內體逃逸,又能使藥物在靶點處有效釋放。ZnO 納米顆粒在生理條件下( pH 7. 4) 保持良好的穩定性,但在 pH 5~6 左右能夠快速分解[50]。Zhang 等[51]利 用 這 一 特 性,合 成 具 有 pH 敏 感 特 性 的 ZnOMSNs,達到內體逃逸效果,實現藥物釋放的可控性。Ma 等[52]將半乳糖、葡聚糖與視黃醛進行綴合,得到 GDR綴合物,分別研究了 pH 為 5. 0,6. 5 和 7 的 PBS 緩沖液中 GDR 納米凝膠的流體動力學尺寸。研究表明,其在 pH= 7. 4 下,粒徑保持不變; 在 pH = 6. 5 下,粒徑有所增加; 在 pH= 5. 0 時,粒徑增大為中性條件下的 3 倍,具有明顯的 pH 敏感效應。通過熒光標記示蹤可知,孵育 6 h 后,包載疫苗的 GDR 與內體共定位,并觀察到有超過 50%的內含物從內體中解離出來,實現內體逃逸。研究推測,腙鍵的裂解消耗大量質子,從而增加了質子、氯離子和水的流入,從而引起內體溶脹和損傷。

  3. 5 脂質材料

  二油酰磷脂酰乙醇胺( DOPE) 及其衍生物在環境中會發生相變,繼而破壞內體膜,相關研究表明,磷脂酰乙醇胺連接不同種類的不飽和脂肪烴鏈在生理條件下為負電性,復合物表現為層狀,在 pH 下降時,PE 質子化使得復合物變為六角形[53]。六角形的復合物對膜具有較大的破壞性,能完成內體逃逸。Safinya 課題組[54]使用小角度 X 射線散射加速器將二油酰三甲基銨丙烷( DOTAP) - 二油酰磷脂酰乙醇胺( DOPE) 的結構與其轉染效率相關聯,DOPE 被發現可以誘導 DNA-脂質復合物從多層結構向個倒六角液晶相的轉變。反向六邊形結構能夠促進與陰離子膜之間的相互作用,導致膜融合和 DNA 釋放。

  4 結 語

  近年來,一系列具有良好的生物相容性、組織滲透性、高靶向性、無毒、易吸收的納米載體得到了廣泛的開發和應用,但內體屏障的存在也限制了納米藥物的發展。目前,通過膜融合或形成膜孔的形式實現內體逃逸的多肽、蛋白類材料逃逸效率高但具有一定免疫原性; 而聚合物類逃逸材料在胞內仍存在一定毒性; 利用仿生粒子實現免疫逃逸,一定程度避免免疫原性,又無細胞毒性,但其不具有普遍作用性,仍難以得到實際應用。在現有載體材料基礎上,通過對內體逃逸機制的進一步了解,將會推動藥物載體的發展和應用。相信隨著對藥物載體在胞內的轉運、代謝及內體免疫等機理的進一步揭示及新型藥物載體的開發,內體逃逸劑將會有更為廣闊的發展空間。

  參考文獻 References

  [1] Yousefpour M M,Yari K A. Cancer Chemotherapy and Pharmacology [J],2017,79( 4) : 637-649.

  [2] Thakur K,Aggarwal G,SI H. World Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences[J],2016,4( 5) : 708-723.

  [3] Stewart M P,Lorenz A,Dahlman J,et al. Nanomedicine and Nanobiotechnology[J],2016,8( 3) : 465-478

  [4] Giodini L,Re F L,Campagnol D,et al. Nanomedicine: Nanotechnology Biology and Medicine[J],2017,13( 2) : 583-599.

  納米藥物載體的結構修飾實現內體逃逸相關論文期刊你還可以了解:《中國藥物與臨床雜志2018年06期投稿論文目錄查詢

轉載請注明來自:http://www.foyspm.tw/fblw/yixue/yaoxue/40209.html

相關文章:

藥學論文發表流程

藥學論文發表流程-搜論文知識網

搜論文知識網是藥學論文發表正規機構。致力于為需要刊登藥學論文的人士提供相關服務。

藥學論文發表咨詢電話:4006800558

相關論文閱讀

優質期刊推薦

省級期刊、國家級期刊、核心級期刊快速發表,藥學論文發表就找搜論文知識網

核心期刊推薦

精品論文推薦

345456蓝月亮心水论坛